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ELISA（實(shí)驗(yàn)條件 技術(shù)要點(diǎn) 原理）

實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)要點(diǎn)：

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,簡(jiǎn)稱ELISA）與免疫酶測(cè)定等名稱所指的內(nèi)容是不相同的，ELISA的內(nèi)容專指固相吸附技術(shù)和免疫酶標(biāo)抗體（或抗原）技術(shù)相結(jié)合的一種方法，它是將抗原或抗體包被在固相支持物（或稱載體上），然后再進(jìn)行免疫反應(yīng)，形成酶標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物，反應(yīng)完畢，借助底物顯示特異結(jié)合的標(biāo)記抗體（或抗原）上的酶活性，用酶與底物反應(yīng)后生成的有色產(chǎn)物進(jìn)行光密度測(cè)定，達(dá)到抗原或抗體定量的目的。

在應(yīng)用ELISA時(shí)，首先要清楚下面內(nèi)容：1，是檢測(cè)抗體還是抗原？2，檢測(cè)的結(jié)果是定性還是定量？3，是否需要檢測(cè)特異抗體的類型？4，所用抗體/單克隆抗體的親和力怎樣？

（1）檢測(cè)抗原  zui常用于檢測(cè)抗原的方法是非競(jìng)爭(zhēng)性的雙抗體夾心法，其次是競(jìng)爭(zhēng)法。但競(jìng)爭(zhēng)法在具體實(shí)驗(yàn)中有些困難，特別是檢測(cè)微生物的抗原，因?yàn)樾枰獦?biāo)記抗原，這對(duì)于某些抗原是很難做到的，甚至是不可能的。另外在競(jìng)爭(zhēng)法中，酶標(biāo)記的抗原與標(biāo)本直接混合在一起，許多標(biāo)本中含有酶抑制劑或蛋白A樣物質(zhì)，可影響ELISA的結(jié)果。

（2）檢測(cè)抗體  檢測(cè)抗體種類常用的方法是檢測(cè)抗體種類的捕獲法，這個(gè)方法常用于檢測(cè)特異性IgG、IgA和IgM.。這個(gè)方法的*步是捕獲所需要檢測(cè)的一個(gè)種類的抗體，接下來(lái)是檢測(cè)捕獲的抗體是否是特異性抗原的抗體。間接ELISA在檢測(cè)IgG時(shí)比較簡(jiǎn)單，但不適用于檢測(cè)其他種類的抗體，因?yàn)檠逯腥绻刑禺?/span>IgG存在將與IgM或IgA等競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗原。

競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗體有兩種方法：一種是將標(biāo)記的抗體和標(biāo)本同時(shí)加入反應(yīng)孔內(nèi)，但標(biāo)記的抗體和標(biāo)本中的抗體必須是結(jié)合抗原的不同決定簇；另一種是先加標(biāo)本，沖洗后再加標(biāo)記的抗體。競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗體比間接法容易判斷結(jié)果，并且比較敏感和特異。不論選擇哪種方法，ELISA都包括6個(gè)步驟：1，抗原或抗體吸附于固相；2.加標(biāo)本和試劑；3，孵育和沖洗；4，加酶標(biāo)抗原或抗體；5，加適當(dāng)?shù)牡孜铮?/span>6，檢測(cè)和分析結(jié)果。

雖然ELISA法在理論上十分簡(jiǎn)單，但每一步都有要注意的事項(xiàng)。不論是新設(shè)計(jì)的ELISA還是沿用其他ELISA方法都有以下幾方面技術(shù)要點(diǎn)：固相載體的選擇和試劑的制備，反應(yīng)條件和操作的標(biāo)準(zhǔn)化。酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)法利用混合的未標(biāo)記抗原和酶標(biāo)記抗原相互競(jìng)爭(zhēng)抗體上的結(jié)合點(diǎn)，從而進(jìn)行抗原的定量。未標(biāo)記抗原的量越大，則酶標(biāo)記抗原和抗體的結(jié)合就越受到抑制。但是競(jìng)爭(zhēng)法在實(shí)驗(yàn)時(shí)比較復(fù)雜，有時(shí)在抗原混合液與相應(yīng)抗體孵育后，在測(cè)定游離抗原與抗體相結(jié)合抗原的活性以前，要先進(jìn)行鹽析或有機(jī)溶劑沉淀或第二抗體沉淀等方法把兩種不同存在形態(tài)的抗原分開。并且在加入底物后，容易產(chǎn)生血清色的物質(zhì)。因此，每次測(cè)定時(shí)都需做空白對(duì)照。由于這些缺點(diǎn)，酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)法使用不多。