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人單核細(xì)胞分離液試劑盒

人單核細(xì)胞分離液試劑盒

產(chǎn)品型號(hào): TBD2011H

所屬分類:分離液試劑盒

產(chǎn)品時(shí)間:2024-08-28

簡(jiǎn)要描述:Store at: RT° C Size :2X100ml
試劑盒內(nèi)容
試劑:全血及組織稀釋液 100ml
試劑:細(xì)胞洗滌液 100ml
試劑A: 100ml
試劑D: 100ml
說明書 1份

詳細(xì)說明:

人單核細(xì)胞分離液試劑盒

Store at:::RT 試劑盒規(guī)格:::2×100ml/Kit

單核細(xì)胞試劑盒內(nèi)容:

全血及組織稀釋液 100ml

細(xì)胞洗滌液 100ml

試劑 A 100ml

試劑 D 100ml

說明書 1

本系列產(chǎn)品目錄

1. 適用于各種動(dòng)物血液及臟器組織本系列產(chǎn)品檢索

2. 相關(guān)試劑及耗材

3. 注意事項(xiàng)

4. 應(yīng)用

5. 產(chǎn)品性能指標(biāo)

6. 貯藏及保存期限

7. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

8. 各種動(dòng)物單核細(xì)胞分離液試劑盒使用方法說明及圖例

9. HES-TBD550 使用說明

10. 組織單細(xì)胞懸液的制備

11. 生產(chǎn)企業(yè)

1. 適用于各種動(dòng)物血液及臟器組織本系列產(chǎn)品檢索:::

2. 注意事項(xiàng)

A 本分離液是敏光型的,在運(yùn)輸和貯藏過程中應(yīng)在 18-25避光保存,啟封后置 4

℃保存避免微生物污染。另外,本品為真空包裝,未啟封前置于 10 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶,

影響分離效果。

B 待分離的血液、組織及細(xì)胞要求新鮮,避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一

定在20水浴箱中復(fù)溫20分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2時(shí)分離效果,

且所有操作過程一定要在無菌條件下進(jìn)行。

C 由于各品牌離心機(jī)的性能不同,國內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異,可能影響

分離效果,用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù),調(diào)節(jié)離心的時(shí)間,摸索*的分離條件(具體分離條件

各實(shí)驗(yàn)室自定)。

D 使用無靜電反應(yīng)的離心管,推薦使用未經(jīng)過堿處理的玻璃離心管。

E *抗凝劑選擇:EDTA、枸櫞酸、肝素。應(yīng)注意在血液稀釋過程中應(yīng)去除抗凝劑

體積。

F 分離過程中所用其他試劑如:羥乙已基淀粉 550、全血及組織稀釋液、細(xì)胞洗滌液及紅細(xì)

胞裂解液等以我公司產(chǎn)品為*選擇,本公司相關(guān)系列產(chǎn)品無菌、無病毒、無支原體、低內(nèi)

毒素水平且無細(xì)胞毒性,所獲得的細(xì)胞可保持完好的生物活性和完整的細(xì)胞形態(tài)。

4. 應(yīng).

適用于從動(dòng)物血液或臟器組織中分離單核細(xì)胞。

5.. . . 產(chǎn)品性能指標(biāo)

pH 7.0-7.5

滲透壓 280-340mOsmol/kg

內(nèi)毒素 0.5...EU/ml

無菌 直接接種培養(yǎng) 14 天后培養(yǎng)基澄清

澄明度及不溶性顆粒物 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下,,,

25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下

6. 貯藏及保存期限 6. 貯藏及保存期限

18-25避光保存,有效期兩年。啟封后置 4保存,有效期一周。

注:若保證無微生物污染,啟封后可置 4長期保存。但應(yīng)注意保存溫度較低時(shí)本分離液易

出現(xiàn)白色結(jié)晶,影響分離效果。

7. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 7. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

A 試劑

單核細(xì)胞分離液試劑盒所含試劑、組織勻漿液、羥乙已基淀粉 550、胎牛血清

B 器材

玻璃離心管、玻璃滴管

水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)、無菌工作臺(tái)

8. 各種動(dòng)物 8. 各種動(dòng)物單核細(xì)胞分離液試劑盒使用方法說明及圖例

A. 10ml 15ml 玻璃離心管中依次小心加入 A、D 兩種液體各 2ml,制成梯度界面(各液面分層一定要清晰);

B 1ml新鮮抗凝血按11比例與全血及組織稀釋液混勻并小心疊加于D液之液面上;或?qū)⒔M織單細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為2×108

-1×109個(gè)/ml,制備方法詳見“10.組織單細(xì)胞懸液的制備方法”)疊加于D液之液面上;

C. 400g(約1500轉(zhuǎn)/分)離心15分鐘(半徑15cm水平轉(zhuǎn)子);

此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分為六層。*層;為血漿(稀釋液)層。第二層;;;為;單核

細(xì)胞層。。。第三層;為透明 D 液層。第四層;為淋巴細(xì)胞層。第五層;為透明 A 液層。第六層;

為極少量紅細(xì)胞層。收集第二層單核細(xì)胞放入含 4-5ml 細(xì)胞洗滌液的試管中,充分混勻后,

500g(約 1800 轉(zhuǎn)/分)離心 20 分鐘,棄去上清留沉淀細(xì)胞重新懸起。重復(fù)洗滌 2 次即得所需單核細(xì)胞。

注::A. 提取率約為 80%。

 B. 分離大量樣品時(shí),具體操作方法請(qǐng)參照我公司“淋巴細(xì)胞快速分離技巧”,查詢路徑:

登陸我公司,在產(chǎn)品搜索中輸入您要的產(chǎn)品名稱→點(diǎn)擊查詢→或者直接我的客服!

 血液(人)中各細(xì)胞含量參考值 中各細(xì)胞含量參考值:::

男:4.0-5.5×1012/L(400-550 萬個(gè)/mm3

)

女:3.5-5.0×1012/L(350-500 萬個(gè)/mm3 紅細(xì)胞 )

新生兒:6.0-7.0×1012/L(600-700 萬個(gè)/mm3

)

成人:4.0-10.0×109

/L(4000-10000 個(gè)/mm3

) 白細(xì)胞 新生兒:15.0-20.0×109

/L15000-20000 個(gè)/mm3

)

血小板 100-300×109

/L10 -30 萬個(gè)/mm3

)

名稱 占白細(xì)胞總數(shù)百分比 占白細(xì)胞總數(shù)百分比

嗜中性粒細(xì)胞 30%-70%

嗜酸性粒細(xì)胞 0.5%-5%

嗜堿性粒細(xì)胞 0%-1%

淋巴細(xì)胞 20%-40%

白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

單核細(xì)胞 3%-8% www.tbdscience.com

9. HES- 9. HES-TBD550 使用說明

HES 是從支鏈淀粉衍生出來的,是富含淀粉的復(fù)合物,其生理和化學(xué)特性主要由羥乙已基

取代度即取代級(jí)、平均分子量決定。大量實(shí)驗(yàn)表明平均分子量越大對(duì)紅細(xì)胞的凝集作用越強(qiáng),

有效提高紅細(xì)胞的沉降速度,從而使紅細(xì)胞與其它細(xì)胞分離。故而,使用 HES-TBD550(羥

乙已基淀粉 550)沉淀法是一種高效的細(xì)胞分離方法。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells ,MSCs) 是指一群可向成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞、

骨髓基質(zhì)細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞分化的多潛能組織干細(xì)胞,是在

細(xì)胞治療、基因治療中有效發(fā)揮作用的理想工程細(xì)胞。MSCs 不僅存在于骨髓,也可從臍血、

外周血中以及脂肪組織、肌肉、胎兒器官、大腦、牙齒中分離。UCB - MSCs 的分離、篩選、

增殖、分化與臍血樣本的選擇、培養(yǎng)基的差異以及分離、擴(kuò)增分化過程中操作技術(shù)等多種因

素有關(guān)。目前用于 UCB - MSCs 分離的方法有:貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀

法和免疫磁珠法。流式細(xì)胞儀法對(duì)細(xì)胞損傷較大,免疫磁珠法價(jià)格相對(duì)較貴且由于抗原抗體

反應(yīng)也容易改變細(xì)胞原有特性,而 HES-TBD550(羥乙已基淀粉 550)聯(lián)合密度梯度離心法常與貼壁篩選法結(jié)合使用,可提高所得 UCB - MSCs 的純度,目前研究多采用此法。國內(nèi)不少學(xué)者采用羥乙已基淀粉沉淀紅細(xì)胞,然后再進(jìn)行離心分離單個(gè)核細(xì)胞,也取得不錯(cuò)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)

證明采用隨機(jī)數(shù)字表法,將每份臍血隨機(jī)分入兩個(gè)不同處理組,從而將臍血樣本的個(gè)體差異

減小到zui小程度。結(jié)果證實(shí),HES-TBD550(羥乙已基淀粉 550)聯(lián)合密度梯度離心法獲得的有核細(xì)胞數(shù)量明顯多于 FICOLL 密度梯度離心法。本實(shí)驗(yàn)采用的羥乙已基淀粉商品名為

HES-TBD550(羥乙已基淀粉 550),克分子滲透壓為 308mosmL,膠體滲透壓為 6836 mmHg,

可影響紅細(xì)胞集聚性沉降率。紅細(xì)胞集聚是可遞性橋接結(jié)構(gòu)形成的結(jié)果,由大的 HES-TBD550

(羥乙已基淀粉 550)分子處在紅細(xì)胞之間聯(lián)接而成。HES-TBD550(羥乙已基淀粉 550)同時(shí)還

阻礙白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附,并使平均血小板容積呈現(xiàn)微弱地降低,從而有輕度抑制血小

板集聚的功能。臍血經(jīng) HES-TBD550(羥乙已基淀粉 550)處理后,可使紅細(xì)胞沉積至試管底,

對(duì)其它主要成分包括干細(xì)胞無影響。經(jīng)這樣處理后,實(shí)驗(yàn)時(shí)間相對(duì)較短(平均為 1.5 h),

步驟相對(duì)較少,細(xì)胞污染幾率小,從而使細(xì)胞數(shù)損失減少。結(jié)論證明,與相應(yīng)的干細(xì)胞分離

液聯(lián)合分離使用羥乙已基淀粉沉淀法是一種高效的臍血干細(xì)胞分離方法。

10. 組織單細(xì)胞懸液的制備 10. 組織單細(xì)胞懸液的制備

注::::A.. .. 本說明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法 本說明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法,,,酶消化法由于各實(shí)驗(yàn)室選取的消化 ,酶消化法由于各實(shí)驗(yàn)室選取的消化酶種類各不相同,,,請(qǐng)各實(shí)驗(yàn)室自行選擇進(jìn)行試驗(yàn) ,請(qǐng)各實(shí)驗(yàn)室自行選擇進(jìn)行試驗(yàn)。。。 。

B. .. 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境 B. 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境。。。 。

剪碎法:::將組織塊放入平皿后 ,加入少量組織勻漿液及 20%胎牛血清;用眼科剪將組織剪至

勻漿狀,加入 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清;用吸管吸取組織勻漿,用 100 目不銹鋼濾網(wǎng)(另購)過濾到試管內(nèi);離心沉淀1500轉(zhuǎn)/分×3 min,再用細(xì)胞洗滌液清洗3次,每次以500rpm

短時(shí)低速離心除去細(xì)胞碎片,以 200 目不銹鋼濾網(wǎng)(另購)過濾去細(xì)胞團(tuán)塊。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并

調(diào)整細(xì)胞濃度為(25)×107個(gè)/ml。常溫下放置, 待測(cè)細(xì)胞的活力。分離前用 20%胎牛血

清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108

-1×109個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液備用。

勻漿器法:用眼科剪將組織剪成小塊;放入 70ml 組織研磨器內(nèi),加入 2ml 組織勻漿液及 20%

胎牛血清;緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)研棒,研磨至勻漿;用 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清沖洗研器;收集

細(xì)胞懸液,經(jīng) 200 目不銹鋼濾網(wǎng)(另購)過濾;離心沉淀 800rpm×2min ,再用細(xì)胞洗滌液

3 次,離心沉淀。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為(25)×107個(gè)/ml。常溫下放置, 待測(cè)

細(xì)胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108

-1×109 個(gè)

/ml 的單細(xì)胞懸液備用。

細(xì)胞計(jì)數(shù)方法:

細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用來計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方法。一般利用計(jì)數(shù)板(血球計(jì)數(shù)板)

進(jìn)行。既可用于分離(散)細(xì)胞培養(yǎng)接種前計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量,也可用于

對(duì)培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。不論計(jì)數(shù)的對(duì)象如何,均須制備分散的細(xì)胞懸液。

計(jì)數(shù)與計(jì)算過程

1)、在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央放置計(jì)數(shù)的蓋玻片。

2)、用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞,讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計(jì)數(shù)板凹蹧處流出懸液,至

蓋玻片被液體充滿為止。

3)、置顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對(duì)于壓線的細(xì)胞只計(jì)數(shù)在上線和左線者,

對(duì)于細(xì)胞團(tuán)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。

4)、按下式計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液的密度:

細(xì)胞密度=(4 個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4)×104個(gè)/ml×稀釋倍數(shù)

公式中乘以 104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為:

1.0mm(長)×1.0mm(寬)×0.1mm(高)=0.1mm3

  1ml1000mm3

細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn):::

A 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí),要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于 104個(gè)/ml,如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離

心再懸浮于少量培養(yǎng)液中;顯微鏡下計(jì)數(shù)時(shí),遇到 2 個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),應(yīng)按單個(gè)細(xì)

胞計(jì)算。如果細(xì)胞團(tuán)>10%,說明細(xì)胞分散不充分; 或細(xì)胞數(shù)<200 個(gè)/10mm2>500 個(gè)/10 mm2

時(shí),說明稀釋不當(dāng),需重新制備細(xì)胞懸液。

B 要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好,否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

C 取樣計(jì)數(shù)前,應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液,尤其是多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混

勻,以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確;

D 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞,若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí),只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)

胞壓在格線上時(shí),則只計(jì)上線,不計(jì)下線,只計(jì)左線,不計(jì)右線。

E 操作時(shí),注意蓋玻片下不能有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中,否則要重新計(jì)數(shù)。

初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤:::

A 計(jì)數(shù)前未將待測(cè)懸液吹打均勻。

B 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

C 滴入懸液時(shí)的量太多,至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。

12. 參考文獻(xiàn) 12. 參考文獻(xiàn)

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中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所灝洋生物聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室監(jiān)制 本品只能用于科學(xué)研究,,,不能用于臨床檢測(cè) ,

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14 朱立平,陳學(xué)清.免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法.人民軍醫(yī)出版社,2000.

貨號(hào)                     品牌              產(chǎn)品名稱                  規(guī)格 報(bào)價(jià)

 

單核細(xì)胞分離液試劑盒    
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